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リバースグライコブロッティング法

 グライコブロッティング法により、目的とする疾患や生体機能に関連する糖鎖を発見出来たとしても、その疾患・機能がどのような臓器・機関でのどのような糖鎖生合成反応に影響しているのかを解明する必要がある。つまり、その糖鎖がどのような血清タンパク質群に結合していたのかを定量的に議論することが切望されている。そこで西村教授グループは、それらのマーカー糖鎖構造を一種のタグとみなして、血清中の総(糖)蛋白質のトリプシン消化物中から該当する糖ペプチド群ごとに選り分けて糖タンパク質を同定する手法を考案した。この方法は非還元末端側の糖鎖に着目して糖ペプチドを捕捉しているのでリバースグライコブロッティング(Reverse glycoblotting)法8)と呼んでいる。特に、末端にシアル酸を持つ糖タンパク質の同定法については、MRM(Multiple Reaction Monitoring)法を用いるターゲット糖ペプチドの定量解析が可能なプロトコルを確立した3)。シアル酸は通常オリゴ糖鎖の非還元末端に存在しているが、これを特異的に過ヨウ素酸酸化することで、アルデヒド基をシアル酸選択的に付与する。このアルデヒド基をヒドラジドビーズに補足することで、シアル酸を有する糖ペプチドを選択的にエンリッチし夾雑物、特にペプチド片やシアル酸を含まない糖ペプチドを徹底的に洗浄して除去する。さらに、ヒドラゾン結合を酸性条件で選択的に切断後、再遊離したアルデヒド体を2-アミノピリジンとの還元アミノ化により蛍光標識する。これにより、その糖ペプチドのグライコミクスに加えて、LC-ESI/MSによるペプチドの配列決定、更には親タンパク質の同定を行うことが達成された。

リバースグライコブロッティング法により同定した糖タンパク質については、それ自身や、その発現制御に関わる遺伝子情報に遡る、いわばセントラルドグマを逆方向に辿ることにより転写メカニズムや翻訳制御の解析を行う多様なアプローチも考えられるだろう。これが、本研究会の名称にもなっているグライコフォームフォーカストリバースゲノミクス(GFRG)の概念である。GFRGの展開により、さまざまなオミクスから提供される情報を横断的に意味付け、関連付けることが可能となる。